مقایسه تکنیک های مختلف اندازه گیری نیتروژن بر اساس روش کجلدال
مقدمه
شیر و تنها چند گونه دیگر از مواد غذایی وجود دارند که تاریخ استفاده از آنها به اندازه تاریخ بشریت قدمت دارند. شیر نه تنها دارای مزه مطبوع است بلکه بسیار سالم و مقوی نیز می باشد به طوری که جز مهم ترین مواد زنجیره غذایی انسان است. این ماده دارای پروتئین فراوان جهت ماهیچه سازی، کلسیم جهت تقویت استخوان و دندان ها، لاکتوز برای انجام هضم مناسب در دستگاه گوارشی و ویتامین مورد نیاز برای تقویت سیستم ایمنی بدن است. پروتئین شیر بسیار با ارزش است زیرا حاوی مقدار فراوانی از اسید آمینه های ضروری است و در نتیجه برای ساختار سلولی انسان بسیار موثر است (ماهیچه، اندام، آنزیم، هورمون و …). مصرف سالیانه شیر در دنیا به 678 میلیون تن می رسد. شیر در فرم های مختلف از جمله ماست و پنیر، شیرینی، بستنی و وعده های غذایی مختلف به مصرف انسان می رسد.
از آنجا که محتوای پروتئین شیر نقش مهمی در قیمت آن و نیز انتخاب نوع گاوهای پرورشی دارد، همواره مورد بررسی و اندازه گیری قرار می گیرد. برای سالیان متمادی روش کجلدال (Kjeldahl) رایج ترین شیوه اندازه گیری پروتئین بوده است. در این روش پروتئین گونه مورد نظر اندازه گیری می شود و در یک ضریب مشخص (38/6 برای شیر) ضرب می شود تا محتوای پروتئین به دست آید. به علاوه شیر حاوی تعداد دیگری از گونه های نیتروژن دار غیر پروتئینی است (NPN) که می توانند موجب تداخل در اندازه گیری ها شوند.
محتوی پروتئین شیر
محتوی نیتروژن شیر شامل 94 پروتئین (تقریبا 1/3 گرم نیتروژن در 100 گرم شیر) و 6 درصد مواد غیر پروتئینی (تقریبا 2/0 گرم در 100 گرم شیر) است. میانگین محتوی پروتئین در شیر حدودا % 3/3 است (با احتساب نیتروژن غیر پروتئینی). گونه های NPN شیر شامل اوره و سایر مواد نیتروژن دار با جرم مولکولی کم مانند کراتین و کراتنین است. پروتئین خالص شیر (پروتئین منهای NPN) شامل کازئین و پروتئین وی (Whey protein) است. کازئین پروتئینی است که 80 درصد پروتئین شیر گاو از آن تشکیل شده است و در اکثر موارد برای تولید پنیر فرآوری می شود.
روش اندازه گیری
هر آزمایشگاهی بسته به نوع کاربری خود از روش های مختلفی برای اندازه گیری پروتئین استفاده می کند. برخی ترجیح می دهند که از روش های منطبق با استانداردهایی مانند §64 LFBG، AOAC، EPA، ISO و DIN که صحت آنها به خوبی اثبات شده است، استفاده کنند. در حالی که برخی دیگر استفاده از روش های سریع، ارزان و سازگار با محیط زیست را ترجیح می دهند. به همین دلیل چند روش اصلاح شده با الهام از روش اصلی به وجود آمده اند. دستگاه های کجلدال ساخت کمپانی Buchi با توجه به قابلیت بالا و انعطاف پذیری مناسب امکان اندازه گیری نیتروژن و پروتئین به روش های مختلفی که در زیر به آنها اشاره می شود، را فراهم می کنند. صحت، دقت، طول عمر بالای دستگاه و راحتی کار از جمله مزایای مهم دستگاه کجلدال کمپانی Buchi است.
روش استاندارد کجلدال
برای اندازه گیری پروتئین شیر با روش کجلدال در ابتدا نمونه در معرض اسید سولفوریک غلیظ قرار می گیرد که منجر به تولید آمونیوم سولفات می شود. سپس در اثر بازی کردن محیط توسط سود، آمونیوم سولفات به آمونیاک تبدیل می شود. آمونیاک تولید شده به داخل دریافت کننده حاوی اسید بوریک تقطیر می شود و سپس با اسید کلریدریک یا اسید سولفوریک تیتر می شود
اندازه گیری کازئین
کازئین در مجاورت اسید استیک رسوب داده می شود و توسط فیلتراسیون از محلول جدا می شود. سپس پروتئین در محلول باقی مانده به روش کجلدال اندازه گیری می شود.
اندازه گيري NPN
در ابتدا کل پروتئین نمونه توسط تری کلرو استیک اسید رسوب داده می شود. سپس نیتروژن در محلول باقی مانده به روش کجلدال اندازه گیری می شود
تقطیر مستقیم شیر
تقطیر مستقیم شیر ساده ترین و سریعترین روش اندازه گیری پروتئین در شیر است، زیرا نیازی به مرحله هضم ندارد. نمونه در داخل لوله قرار داده می شود و قبل از آغاز تقطیر به آن کلرید باریم اضافه می شود. در ادامه سایر مراحل مطابق روش استاندارد کجلدال انجام می شوند. قبل از اندازه گیری نمونه شیر ضروری است تا فاکتور تبدیل (نسبت بین کل نیتروژن پروتئینی به نیتروژن آمونیاکی) به دست بیاید تا میزان تیترانت مصرفی برای پروتئین قابل تعیین باشد.
روش کجلدال با هضم توسط آب اکسیژنه (H2O2)
هضم با آب اکسیژنه بیشتر برای نمونه های دودزا مفید است. به هر حال انجام این روش احتیاج به یک ماژول مکنده ویژه (Special suction module) برای جلوگیری از جریان بخارات نیاز دارد (شکل 2). از مزایای این روش می توان به کاهش 75 درصدی زمان هضم، جلوگیری از تولید دود در مرحله هضم و سازگاری با محیط زیست (به دلیل عدم استفاده از کاتالیست های فلزات سنگین) اشاره کرد. برای انجام این روش در ابتدا نمونه و اسید سولفوریک وارد لوله می شوند و سپس ماژول مکنده شروع به کار می کند. در طی مرحله هضم از خلال قیف کاپیلاری دو بار به مخلوط آب اکسیژنه اضافه می گردد
روش ميکروکجدال
این روش مطابق روش استاندارد انجام می گیرد فقط به مقدار کمتری از نمونه شیر نیاز دارد (حدود 8/1 میلی لیتر)، مواد شیمیایی کمتری مصرف می کند و زمان فرایند هضم را به طرز چشمگیری کاهش می دهد. در ادامه نتایج به دست آمده از روش های مختلف با هم مقایسه شده اند.
نتايج
در این مطالعه روش کجلدال و روش های اصلاح شده آن که توسط دستگاه کجلدال کمپانی Buchi انجام شده اند بررسی شده است. همانطور که از نتایج ارائه شده در جداول بالا مشخص است، روش های اصلاح شده کجلدال نیز می توانند برای به دست آوردن نتایج تکرار پذیر به کار روند. بدین معنی که این روش ها می توانند به عنوان جایگزین روش اصلی در آزمایشگاه استفاده شوند. همه روش های ارائه شده نتایج رضایت بخشی به دست می دهند. لذا کاربران می توانند مناسب ترین روش را که برآورده کننده خواسته های آنها باشد انتخاب کنند. به عنوان مثال روش میکرو کجلدال می تواند موجب کاهش زمان آزمایش و مواد شیمیایی مصرفی شود در حالی که روش هضم با H2O2 می تواند نتایج با صحت بالا ارائه کند در حالی که آنالیزها در کوتاه ترین زمان ممکن صورت گیرند. اگر در جایی استانداردهای رسمی مانند AOAC یا DIN ضروری باشد، نمی توان از روش های اصلاح شده استفاده کرد.
منابع
[1] http://www.thedairysite.com/articles/1755/milk-and-milk-products-a-global-market-analysis
[2] http://www.indexmundi.com/agriculture/?commodity=milk&graph=production
[3] http://www.milchindustrie.de/de/eu/agrarpolitik/quote/
[4] http://de.wikipedia.org/wiki/Milch
[2] http://www.indexmundi.com/agriculture/?commodity=milk&graph=production
[3] http://www.milchindustrie.de/de/eu/agrarpolitik/quote/
[4] http://de.wikipedia.org/wiki/Milch